Также рекомендуем посетить:

Стандартизация уколов иглами и оценка новых перчаток G-VIR

Россия - Москва

В качестве маркера в желатиновой модели in vitro использовали вирус Herpes simplex I типа (HSVI), являющийся моделью вируса с оболочкой. Было показано, что из изученных экспериментальных параметров наибольшее влияние оказывают диаметр иглы и глубина прокола, в то время как скорость прокалывания, угол прокола и степень растяжения перчатки имеют меньшее значение. Одна перчатка уменьшает количество попадающей крови на 52% по сравнению с уколом без перчаток; надевание двух перчаток не дает дополнительной защиты от уколов полыми иглами. При стандартизированных условиях проколов хирургические перчатки G-VIR® снижают количество заносимого HSVI на 81% по сравнению с одинарными или двойными перчатками из латекса.

Введение

Медицинские работники озабочены возможностью случайного попадания крови зараженных вирусами пациентов. В настоящее время заражение вирусом гепатита В (HBV) может быть предотвращено вакцинацией, в то время как в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) возможна лишь постэкспозиционная профилактика, а в отношении вируса гепатита С (HCV) эффективные профилактические меры отсутствуют. Среди всех несчастных случаев с попаданием крови, о которых сообщалось в литературе, максимальный риск связан с уколами иглами. Этот риск оценивается в 0,5 – 3% для HCV и в 0,3% для ВИЧ 1,2.



Для предупреждения попадания крови и жидкостей тела рекомендуется защита рук, но вопрос об эффективности в отношении проколов одинарной или даже двойной системы перчаток часто остается открытым. Резиновые перчатки не защищают от проникновения иглы в кожу, и эффективность таких «пассивных» слоев в предупреждении передачи вируса связана с очищением внешней поверхности прокалывающего кожу устройства. Это относится в первую очередь к устройствам с простой геометрией, например, с шовными иглами, но это «вытирающее» действие становится неэффективным в случае глубоких проколов полыми иглами или повреждений другими острыми предметами вроде лезвий скальпеля, пористых костных фрагментов и т. п. Для обеспечения более высокого уровня защиты были разработаны перчатки G-VIR® с включением капельного слоя жидкого дезинфицирующего средства, заключенного между двумя механическими слоями. При случайном проколе или разрезе высвобождение этой жидкости в месте повреждения обеспечивает защиту в результате значительного уменьшения количества заносимых вирусов 4,5.



Основным фактором риска является количество инокулируемых вирусов, прямо связанное с вирусной нагрузкой пациента и с объемом случайно внесенной крови 6. Для создания репродуцируемого теста, моделирующего несчастный случай с уколом полой иглой при точном контроле экспериментальных параметров, мы разработали автоматизированный аппарат для проколов с возможностью количественного определения in vitro заносимых вирусов. Мы представляем результаты первоначальной серии экспериментов с использованием в качестве «маркера» вируса herpes simplex (HSVI). Цель экспериментов – изучение основных факторов, влияющих на объем заносимой крови (глубины прокола, диаметра иглы, скорости и угла прокалывания, толщины перчаток и степени их растяжения). Определенные в экспериментах «стандартизированные» условия затем использовали для оценки защитных свойств перчаток G-VIR® в сравнении с перчатками других производителей с использованием HSV1 как модели вирусов с оболочкой, к которым относятся вирусы ВИЧ и HCV5.



Методика



Перчатки

Использовали три типа перчаток: перчатки G-VIR® - синтетические хирургические перчатки без талька (фирма Hutchinson Santé, Франция), содержащие жидкий дезинфектант (четвертичные соли аммония и хлоргексидин) внутри микроскопических капель, равномерно распределенных в слое толщиной 500 нм, два типа перчаток, предоставленных Hutchinson Santé, сходных с G-VIR®, но без дезинфектанта внутри, и стандартные латексные хирургические перчатки (Dermotact®, Wuhrlin Soplamed, Courbevoie, Франция) одинарной (250 нм) или двойной (500 нм) толщин.



Культуры клеток

Клетки Vero (ECACC № 84113001, ATCC, UK) культивировали на модифицированной по Дюльбекку среде (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Франция) с добавлением L-глутамина, антибиотиков и 10 %-ной фетальной сыворотки теленка (Gibco, Paiseley, Великобритания). Монослои клеток выращивали в термостате (37 °С, 5% СО2). При пересевах первичных культур клетки отделяли с помощью 0,1%-ного раствора трипсин/ЭДТА. Среду меняли каждые три дня.



Штамм вируса

Использовали штамм Bey HSV1, культивируемый на клетках Vero. Инфицированные монослои собирали тогда, когда цитопатогенный эффект вируса был выражен у всех клеток. После трех циклов замораживания – оттаивания вирус гомогенизировали и сохраняли до использования с клеточным детритом в ростовой среде при –74 °С. Инфекционный титр, определяемый стандартным методом бляшек, выражали в содержании бляшкообразующих единиц (БОЕ/мл) 7. Во всех экспериментах использовали вирусный раствор с 10 (6) БОЕ/мл, приготавливаемый 10-кратным разведением в дефибринированной крови овцы (AES Chemunex, Франция). Титр вируса определяли в начале и в конце экспериментов, и он сохранял стабильность. Один и тот же штамм вируса использовался во всех экспериментах.



Автоматизированный аппарат для уколов

Аппарат состоит из пневматического удерживающего иглу устройства и шприца, смонтированных на вертикальном направляющем устройстве, позволяющем производить точную установку глубины укола. Давление воздуха контролируется манометром; скорость укола можно изменять, регулируя воздушный поток.



Из тыльного слоя перчатки вырезали квадраты 8 х 8 см, которые закрепляли на жесткой рамке для контроля растяжения. Угол между иглой и образцом устанавливали в 90° или 45°, располагая образец горизонтально или под углом 45° по отношению к игле. Время пребывания иглы в среде инфектанта было не более 0,5 сек.



Тест с уколами

Полые иглы (MicroLance, Becton Dickinson, Fraga (Huesca), Испания) и катетеры Jelico, Medex, Haslingden, Великобритания) от 25G до 16G прикрепляли к шприцу вместимостью 1 мл (Terumo Europe, Leuven, Бельгия) погружали на 2 см в вирусную суспензию. Кровь засасывали через иглу в шприц и выливали, оставляя каплю крови на кончике иглы, после чего шприц закрепляли на аппарате для уколов.



Образцы перчаток прокалывали с заданными скоростью, глубиной и углом, не прилагая силы к поршню шприца. Переносимый объем крови собирали в микропробирку (Eppendorf AG, Hamburg, Германия), заполненную 1,2 мл накопительной среды DMEM. Среда была слегка желирована с помощью 4% (по весу) желатина (LPB1 50, Rousselot SAS, Courbevoie, Франция) для имитации кожного эффекта и во избежание капиллярного пассивного переноса.



После укола накопительная среда разжижалась при 37°С, после чего ее наносили на сплошной клеточный монослой, культивируемый в 60-мм чашке для культур тканей (Becton Dickinson). После двухчасовой инкубации (37°С, 5% СО2) к культуральной среде добавляли 1% человеческой сыворотки (Sigma) и инкубировали 3 дня, после чего проводили визуальный подсчет бляшек.



Для каждого условия эксперимента проводили по 15 уколов (по одному на микропробирку), используя для каждого укола новую иглу.



Калибровочная кривая объем/БОЕ

С целью установления соответствия количества бляшек и переносимого объема была построена калибровочная кривая, учитывающая клеточную реакцию в присутствии желатина и крови.



1 мкл желированной накопительной среды, содержащей 0,2 мкл вирусной суспензии в крови наносили на клеточный монослой для подсчета бляшек в ряду разведений от исходной вирусной суспензии в крови (титры от 105 до 5 х 106 БОЕ/мл). Затем число бляшек регистрировалось и сопоставлялось с количеством внесенных вирусов.



Данные анализов

Для каждого исследуемого параметра проводилось по три раздельных эксперимента. Средние значения по 45 полученным данным обрабатывали и выражали в 99,5%-ном доверительном интервале с использованием t-критерия Стьюдента. Для определения оказывающих значительное влияние на объем крови параметров различия средних оценивали с помощью программы анализа вариабельности ANOVA с использованием Statgraphics Plus (v5.1, Manugistics, Inc., Rockville, США). Уровень достоверности приняли P< 0.05. Если результаты представляли особый интерес, применялся регрессионный анализ.



Результаты



Выработка протокола

Сначала для определения влияния основных механических параметров на объем вносимой крови проводили эксперименты с применением широко распространенных инъекционных игл 22G. Если нет особых указаний, уколы проводили через одинарный слой перчатки.



Калибровочная кривая. Линейный регрессионный анализ связи числа бляшек с количеством внесенных вирусов показывает хорошее совпадение с графиком уравнения y=0,78x+20,6 (данные не показаны, R2=0.96, P= 0.022). Поскольку все уколы проводили с одним и тем же штаммом вируса, эта калибровочная кривая использовалась во всех экспериментах для определения объема крови как функции титра вирусной суспензии и подсчитанного числа бляшек.



Глубина укола (рис. 1а). Вносимый объем крови существенно увеличивается с увеличением глубины прокола (Р < 0,001): от 0,07± 0,02 мкл (при глубине 3 мм) до 0,24 ± 0,04 мкл (при глубине15 мм ). В данных пределах изменение объема было линейным (R2= 0.97, P= 0.0022). Глубина 6 мм рассматривалась как характерная для повреждений при глубоком уколе и была определена как стандартная.



Размер иглы (рис. 1b). Объем вносимой крови возрастает с увеличением наружного диаметра и диаметра канала иглы (Р < 0,001), варьируя от 0,048 ± 0,01 мкл (25G) до 0,47±0,07мкл (16G ). Результаты соответствуют уравнению..